Expression hétérologue des gènes cry3Bb1 et cry3 pour une résistance accrue contre les insectes ravageurs du coton

Matières végétales

Le génotype Eagle-2 (Gossypium hirsutum L.) a été utilisé pour l’expression de deux cri gènes (cryBb1 et cry3). Les graines saines d’Eagle-2 ont été obtenues auprès de Four Brothers Seeds Multan-Pakistan et ont été cultivées dans la ferme de recherche de Four Brothers Lahore-Pakistan.

Développement de gènes cry synthétiques

Séquences génétiques de cri gènes (pleurer3, n° d’accession. AY572010.1 ; cry3Bb1, n° d’accession. spIQ06117I1-652) ont été extraits du NCBI et, après optimisation des codons, ont été synthétisés par [BIOBASIC, CANADA]. Le double synthétique cry3Bb1 gène et pleurer3 cassette de gène (total 3915 pb) ont été clonés dans le NcoI, SacI et Ahd1(endonuléases de restriction) sites de restriction du vecteur pUC57. Tous les gènes étaient sous régulation de CaMV35S promoteur, et Nos un terminateur a été ajouté à la fin de ces gènes (Fig. 1).

Développement de vecteur de transformation végétale

Le vecteur pUC57 portant cry3Bb1 et pleurer3 la cassette de gènes a été transformée dans le top 10 E. coli Cellules compétentes en utilisant la méthode du choc thermique et sélectionnées sur un milieu LB contenant de l’ampicilline (50 µg/mL) et de la tétracycline (50 µg/mL). Le kit d’isolement d’ADN plasmidique Gene Jet (Thermo Scientific Vilnius, Lituanie, Cat # K0503) a été utilisé en suivant les instructions du fabricant. Pour la confirmation de cry3Bb1et pleurer3 gènes, la digestion de restriction a été effectuée en utilisant Ncol et AhdI Enzymes. Un fragment d’ADN de 3,9 Kb de cry3Bb1, et pleurer3 cassette ont été observées sur un gel d’agarose à 0,8 %. Pour la purification des fragments élués, le kit d’extraction de gel Gene JET (Thermo Scientific Vilnius, Lituanie, Cat # K0503) a été utilisé. Le fragment d’ADN purifié (cry3Bb1 et pleurer3 gènes) a été ligaturé dans pCAMBIA1301 (vecteur d’expression végétale), pré-digéré avec les enzymes de restriction correspondantes. Un marqueur d’ADN de 10 Kb (250 bp à 10 Kb) (GeneRuler, Thermo Scientific, Cat#SM0311) a été utilisé pour évaluer la taille des fragments d’ADN résolus.

Pour confirmer la ligature des gènes cry mentionnés ci-dessus dans le vecteur pCAMBIA1301, une digestion de restriction a été effectuée avec Ncol et AhdI Enzymes. De plus, le clonage de ces gènes a également été confirmé par PCR en utilisant des amorces spécifiques au(x) gène(s) indiquées dans le tableau 4.

Tableau 4 Séquences des amorces utilisées pour la confirmation du clonage des gènes recherchés dans le vecteur de transformation finale pCAMBIA1301.

Les conditions suivantes ont été utilisées pour l’amplification des gènes cry ; Dénaturation initiale (94 °C pendant 3 min), dénaturation (94 °C pendant 45 s), annelage (59 °C pendant 50 s), extension (72 °C pendant 1h30 min) et extension finale (72 °C pendant 10 minutes). Par électroporation, les plasmides confirmés ont été transformés en A. tumefaciens souche LBA4404 cellules compétentes28. Les milieux YEP (Peptone 10 g/L, Yeast extract 10 g/L, Sodium chloride 5 g/L, pH 7,5) contenant de la Kanamycine (50 mg/ml) et de la Rifampicine (50 mg/ml) ont été utilisés pour la sélection des recombinants. Agrobactérie cellules. Une PCR sur colonie a été réalisée pour la sélection des Agrobactérie clones.

Transformation génétique du génotype de coton sélectionné

Les graines stérilisées en surface d’Eagle-2 (coton upland) ont été incubées dans l’obscurité à 30 ° C pendant 48 h. La méthode de coupe de l’apex des pousses a été utilisée pour la co-transformation des semis germés. Avant l’incubation, les embryons isolés ont été blessés à l’apex des pousses et ont été traités avec Agrobactérie souche LBA4404 hébergeant le pCAMBIA1301-cry. Les cultures ont été incubées pendant 1 h. à 28 °C en plaçant les explants sur un milieu solide MS additionné de (MS 4,4 g/L, Saccharose 30 g/L, Phytagel 2,4 g/L). Après 48–72 h. d’incubation, les embryons ont été cultivés sur des milieux MS additionnés de céfotaxime (500 mg/ml), suivis d’un criblage dans des tubes MS contenant de l’hygromycine (25 mg/ml) pendant 1,5 mois. Après le criblage, les plants de coton ont été transférés dans des pots contenant une proportion égale de sable, d’argile et de tourbe (1:1:1). Par la suite, les plantes transgéniques putatives ont été transférées dans des serres de Four Brothers Genetics Inc. pour l’acclimatation et le durcissement. Par la suite, des analyses moléculaires ont été effectuées afin d’évaluer l’intégration et l’expression du transgène. Les données numériques de la transformation génétique ont été enregistrées dans le tableau 1.

Détection de l’intégration du gène double cry dans le génome du coton

Les feuilles (généralement la troisième feuille) ont été récoltées à partir de plantes transgéniques putatives pour l’isolement de l’ADN pour le criblage par PCR de Cry3Bb1 et Cry3 intégration de gène(s). A cet effet, le kit PCR master mix (Thermo Scientific, cat#K1081) a été utilisé avec des amorces spécifiques. Pour annuler la Agrobactérie contamination, l’amplification de virG gène a également été réalisée à l’aide d’un ensemble spécifique d’amorces de la vir Région.

Analyse de l’expression des transformants putatifs du coton

Le kit Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, États-Unis, Cat # 5185-6000) a été utilisé pour l’isolement de l’ARN à partir de transformants de coton putatifs. Le spectrophotomètre Nano Drop ND-1000 (à 260 et 280 nm) a été utilisé pour la quantification de l’ARN. En utilisant le kit de synthèse d’ADNc premier brin (Thermo Scientific, Cat #K1632), l’ADNc a été préparé à partir de l’ARN total traité à la DNase. Cet ADNc a été stocké à -20 °C.

La qPCR a été réalisée pour l’analyse de l’expression des transgènes avec des amorces spécifiques en triple exemplaire avec une taille de produit < 200 bp en utilisant Maxima SYBR Green/ROX (Thermo Scientific, Cat#K0221). Le mélange réactionnel de 20 µl avec 1 µl d'amorces inverses et directes de 10 pmol, 5 µl de Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×) et 1 µl (50 ng/µl) d'ADNc. Les séquences d'amorces pour l'amplification des deux gènes sont données dans le tableau 4. L'expression relative a été déterminée selon les 2 (−ΔΔCt) méthode utilisant des amorces GAPDH comme contrôle interne (gène de référence) pour la normalisation en réaction. Tous les dosages ont été réalisés en triple.

Essais biologiques sur les insectes

Un essai biologique sur les insectes a été exécuté pour évaluer les impacts toxiques des plants de coton transgéniques et non transgéniques contre les larves de ver rose et de ver légionnaire. Les feuilles fraîches développées des plantes positives à la PCR ont été identifiées et placées dans une boîte de Pétri pour un essai biologique. 5 à 7 larves de chenille légionnaire du 3e stade ont été utilisées par feuille en triple exemplaire. De même, des vers roses de la capsule du 3ème stade ont été lâchés sur les plantes transgéniques et non transgéniques au champ. L’efficacité des plantes transgéniques contre le ver rose de la capsule et le ver légionnaire de la capsule a été évaluée. L’ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour l’analyse statistique. Pendant 3 jours, le taux de mortalité a été enregistré en continu à l’aide de l’équation suivante ;

$$ % {text{ Mortalité }} = {text{Nombre de larves mortes}}/{text{Nombre total}}. {text{ de larves}} times {1}00. $$

Implication dans la recherche avec des participants humains / ou des animaux

La recherche n’implique pas de participants humains et animaux.

Consentement éclairé

J’ai lu et je comprends les informations fournies et j’ai donné la permission de poser les questions. Je comprends ma participation à la recherche et je suis susceptible de produire les informations fournies à tout moment. Les feuilles des plantes ont été prélevées avec la permission de FB Genetics Four Brothers Group Lahore.

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